实验常见问题分析与解决方案

上海金鹏分析仪器有限公司针对WB做不好的常见问题分析与解决方案：

问题	可能原因	验证或解决办法
背景较高	封闭不充分	延长封闭时间，更换合适的封闭剂(脱脂奶粉，BSA,血清等)
	一抗浓度过高	增加一抗稀释倍数，
	抗体孵育温度过偏高	建议4℃孵育
	二抗非特异性结合 或与封闭剂交叉反应	设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度
	一抗或二抗与封闭剂有交叉反应	在孵育和洗涤液中加入Tween-20以减少交叉反应.
	洗膜不充分	增加洗涤次数
	膜不合适	NC膜比PVDF膜背景低
	膜干燥	保证充分的反应液，避免出现干膜现象
没有阳性条带 或很弱	一抗、二抗等不匹配	订购试剂时认真选取一抗与组织种属， 一抗与二抗或/和底物与酶 系统之间相匹配的抗体及底物。可通过设置内参可以验证二级检测 系统的有效性。
	-抗或/和二抗浓度低	增加抗体浓度，延长孵育时间
	封闭剂与一抗或二抗有交叉反应	封闭时使用温和的去污剂，如TWEEN20,或更换封闭剂(常用的 脱脂奶、BSA、血清或明胶
	一抗不识别目的物种的靶蛋白	检查说明书，或做ClustalW比对，设阳性对照
	样本中无靶蛋白或靶蛋白含量过 低(抗原无效)	设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中 不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加标本上样量至少每孔   20-30ug蛋白，样本制备时使用蛋白酶抑制剂，或分级提取目的蛋白。
	转膜不充分，或洗膜过度	使用丽春红S检测转膜效果，PVDF膜需浸透，需正确的转膜操作，勿 过度洗膜
	过度封闭	使用含0.5%脱脂奶或无脱脂奶的抗体稀释液，或更换封闭剂，减少 封闭时间
	一抗失效	使用有效期内抗体，分装保存，避免反复冻融取用，工作液现配现用
	二抗受叠氮钠抑制	所用溶液和容器中避免含有叠氮钠(HRP的抑制剂)
	酶和底物失效	直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了、选择在有 效期内、有活性的酶联物，使用新鲜的底物.
	曝光时间过短	延长曝光时间
多非特异性条 带 或条带位置不 对	细胞传代次数过多，使其蛋白表 达模式的分化	使用原始或传代少的细胞株，或平行实验
	体内表达的蛋白样本具有多种修 饰形式：乙酰化、磷酸化、甲基 化、烷基化、糖基化等	查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小
	蛋白样本降解	使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂
	新蛋白或同族蛋白的分享同种表 位的不同剪接方式	查其它文献报导，或BLAST搜寻，使用说明书报导的细胞株或组织
	一抗浓度过高	降低抗体浓度，可以减少非特异性条带
	二抗浓度过高产生非特异性结合	降低抗体浓度，增加二抗对照 选择特异性更强，只针对重链的二抗
	抗体未纯化	使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带
	蛋白存在二聚体或多聚体	SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10 min,