蛋白纯化常见问题（二）

那么下面上海金鹏分析仪器有限公司为大家简单介绍一下蛋白纯化常见问题（二）。
Q：Superdex 75( 球蛋白分离范围 3 – 70 KDA)， Superdex 200 (10 – 600 KDA) 和 Superose 6(5-5000 KDA)，分离范围有重叠，如何选择？
A：一般使待分离样品的分子量位于线性分离范围中部。根据分子量 Marker 在三种柱子上的表现，三者常规推荐 ：蛋白分子量在 40 kDa 以下 (3 kDa 以上 ) 考虑使用 Superdex 75；40 – 400 kDa的样品考虑使用 Superdex 200；分离 400 kDa 以上样品时，建议选择 Superose 6 Increase。

Q：脱盐实验中的缓冲液如何选择？
A：如果我们用缓冲液 A 来平衡柱子，上样后，走外水的样品其实是跟着平衡时的缓冲液 A 出峰并溶解在其中的（而非*后赶样品用的洗脱缓冲液）。因此，希望样品溶解在缓冲液 A 中，就用缓冲液 A 来平衡柱子。缓冲液的选择，依据实验需求和填料本身耐受性，同时确保样品在该缓冲液中稳定存在。通常，使用 10-50 mM 磷酸钠缓冲液，至少含有 25 mM NaCl 用于避免离子作用的非特异性吸附，中性 pH 7.0 ~ 7.4。或挥发性缓冲液如 100 mM 乙酸铵或碳酸氢铵。

Q：纯化得到的组分中没有或很少目的 His 标签蛋白，怎么回事？
A：若目的 His 标签蛋白正常表达（使用抗 His 标签的抗体进行 WB 检测）且充分释放至上清中，确认蛋白是流穿还是未被洗脱：
若 His 标签蛋白流穿 ：
样品或结合缓冲液的条件不合适，注意螯合剂或强还原剂以及咪唑的浓度。
His 标签蛋白与填料的结合较弱：降低上样流速或增加孵育时间 ；增加标签 His 的数量（常用 6 – 10 个）。
His 标签未充分暴露：在变性条件（4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 盐酸胍） 下进行纯化或测试；重新构建克隆，改变 His 标签的位置。
尝试其他的金属离子：如 锌离子，钴离子等。
若 His 标签蛋白未洗脱：
洗脱条件过于温和：增加咪唑浓度或降低洗脱 pH（注意：pH降至 4.0 以下时 Ni2+ 会发生脱落）。
目的蛋白与填料发生非特异性疏水或其他相互作用：在洗脱缓冲液中加入非离子型去垢剂（如 2% Triton X-100）或提高 NaCl浓度。
目的蛋白在填料中发生了沉淀：减少上样量；使用咪唑线性梯度而不是步级洗脱以降低洗脱得到的蛋白浓度；使用去垢剂或改变 NaCl 浓度；在变性条件 (4 – 8 M 尿素或 4 – 6 M 盐酸胍 )下洗脱。


以上就是上海金鹏分析仪器有限公司为大家整理总结关于蛋白纯化常见问题（二）。
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